使用 Lumicounter 的抗氧化作用測量方法

通過呼吸作用進(jìn)入體內(nèi)的大約 3% 的氧氣在電子傳遞鏈的能量代謝過程中被還原為超氧陰離子 (O2-)、過氧化氫 (H2O2)、羥基自由基 (.OH) 和單線態(tài)氧 (1O2) 和其他活性氧。已經(jīng)指出，這些活性氧使蛋白質(zhì)變性并破壞DNA中的抗癌基因，從而引起癌變。

另一方面，人體有清除活性和抗氧化物質(zhì)，如抗壞血酸和α-生育酚等，如超氧化物歧化酶（SOD）氧可將氧氣清除。近年來，尋找具有抗氧化能力的物質(zhì)，如兒茶素和異黃酮等多酚類物質(zhì)，以及作為它們的輔助物質(zhì)的物質(zhì)受到關(guān)注，并且正在進(jìn)行對其能力的分析。在這里，我們總結(jié)了使用化學(xué)發(fā)光測量自由基清除能力的方法作為抗氧化能力的測量方法。

圖1　活性氧的產(chǎn)生與去除

原則

化學(xué)發(fā)光法

化學(xué)發(fā)光是由發(fā)光底物的氧化引起的。使用金屬離子或鐵等絡(luò)合物作為催化劑，魯米諾被 H2O2 氧化，形成 3-氨基鄰苯二甲酸。此時(shí)首先成為激發(fā)單重態(tài)，成為基態(tài)后發(fā)出藍(lán)色光。

魯米諾反應(yīng)

抗氧化能力評價(jià)

通過測量發(fā)光底物的目標(biāo)物質(zhì)對發(fā)光的氧化抑制，可以測量目標(biāo)物質(zhì)的抗氧化能力。作為抗氧化能力的指標(biāo)，有一種方法可以檢查酶反應(yīng)產(chǎn)生的自由基的自由基清除能力。另外，在ESR（電子自旋共振）方法中，產(chǎn)生的自由基被DMPO捕獲并測量為自由基強(qiáng)度。因此，間接追蹤超氧化物的消除，而發(fā)光測量直接測量活性氧裂解時(shí)產(chǎn)生的發(fā)光，因此可以說是一種更直接的測量方法。

次黃嘌-黃嘌氧化酶-O2-的底物，是酶促反應(yīng)產(chǎn)生的一種活性氧，用魯米諾、光澤精或Cypridina熒光素衍生物等使之發(fā)光，用發(fā)光量計(jì)測定發(fā)光量。發(fā)光計(jì)數(shù)器。此時(shí)計(jì)算抑制率（抑制率（%）=1-B/A×100），其中A為未添加抗氧劑時(shí)的發(fā)光量，B為添加抗氧劑時(shí)的發(fā)光量. 可以推斷，抑制率越高，抗氧化效果越高。另外，根據(jù)SOD的抑制率，將每單位重量樣品的抑制率換算成等量的SOD，可以進(jìn)行定量測定。

圖2 抗氧化作用測量原理

次黃嘌0-黃嘌0氧化酶系統(tǒng)中的 O2- 產(chǎn)生

抗氧化能力測定例

O2- 由次黃嘌0-黃嘌0氧化酶反應(yīng)產(chǎn)生，并使用發(fā)光試劑發(fā)光。添加抗氧化劑作為樣品并獲得抑制率。

■ 試劑

• KH2PO4 緩沖液 (0.1M-KH2PO4-0.05mM-EDTA)

• 次黃嘌0溶液（3.6mM-次黃嘌0/KH2PO4 緩沖液）

• 黃嘌0氧化酶溶液（100μg/mL-黃嘌0氧化酶溶液）

• 發(fā)光試劑

■ 測量

使用 Lumicounter 進(jìn)行測量。由于是高靈敏度的微弱光測量儀，請避開窗戶等有直射光的地方，并注意濕度。NU-700 可以在微型管中進(jìn)行測量。此外，NU-2500具有攪拌功能，通過每隔一定時(shí)間反轉(zhuǎn)并稍微偏離旋轉(zhuǎn)軸中心的攪拌裝置，即可有效攪拌樣品。

圖 3 Lumicounter NU-2500

(A)未添加抗氧化劑的微管

• 發(fā)光試劑

• 黃嘌0氧化酶溶液

• KH2PO4緩沖劑

被分配并設(shè)置在設(shè)備中。從自動移液器中分裝黃嘌0溶液并測量積分發(fā)光值一分鐘。

(B)添加到微管中的抗氧化劑

• 發(fā)光試劑

• 抗氧化劑

• 黃嘌0氧化酶溶液

• KH2PO4緩沖劑

被分配并設(shè)置在設(shè)備中。從自動移液器中分裝黃嘌0溶液并測量積分發(fā)光值一分鐘。

應(yīng)用領(lǐng)域

抗氧化能力測量和活性氧測量用于以下領(lǐng)域。

• 新型功能性食品的研發(fā)
  水稻過氧化物酶活性的測定 稗子中 自由基
  清除成分的測定
  過氧化氫對發(fā)芽 生根的影響
  
  

• 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域
  活性氧在體內(nèi)作用機(jī)制的闡明
  體內(nèi)氧化應(yīng)激
  的測量 灌注系統(tǒng)中NO的測量 肝損傷
  枯否細(xì)胞 的活性氧生產(chǎn)能力
  
  

• 分析化學(xué)
  發(fā)光試劑的開發(fā)
  測量方法的開發(fā)
  分子探針的開發(fā)

• 其他
  光催化反應(yīng)產(chǎn)生的活性氧的測量
  魚類中性粒細(xì)胞活性氧產(chǎn)生能力的比較魚種間牛乳腺炎
  化學(xué)發(fā)光早期診斷

除了測量活性氧之外， Lumicounter還可用于多種用途，例如以下用途。

• 使用報(bào)告基因的分析使用
  報(bào)告基因的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)功能分析（啟動子、增強(qiáng)子等的活性分析）
  

  1. 熒光素酶測定
  2. 使用磷酸酶
  進(jìn)行分析 3. 使用 β-半乳糖苷酶進(jìn)行分析

• 通過 ATP 測量測量細(xì)菌和細(xì)胞計(jì)數(shù)
  

  1. 食品、廢水、土壤等中生物量的測量
  2. 食品工業(yè)工作場所的衛(wèi)生檢查
  3.通過測量細(xì)胞中的ATP來調(diào)查細(xì)胞活性
  4. 細(xì)菌和酵母等微生物的細(xì)胞計(jì)數(shù)測量
  5.種子、植物生長率測定等

• NAD(P)H系統(tǒng)發(fā)光信號的測量與分析
  來自發(fā)光細(xì)菌的熒光素酶在存在下催化還原的黃素單核苷酸和6-8個(gè)碳鏈的長鏈醛氧化成長鏈脂肪酸的反應(yīng)酶。發(fā)光發(fā)生。

  1. NAD(P)H 定量
  2. FMN 定量
  3. 酶聯(lián)免疫分析

• 應(yīng)用化學(xué)發(fā)光
  魯米諾、光澤精等化學(xué)發(fā)光。

  1.化學(xué)發(fā)光法檢測吞噬活性2.
  水母蛋白測定Ca2+濃度3.化學(xué)
  發(fā)光法定量Ach（乙酰膽堿）等